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酵母β-半乳糖苷酶的測定
更新時間:2012-02-13   點擊次數(shù):2413次

1) 粗提取物測定
1.在適當溫度下(通常30℃),用適當培養(yǎng)液將5ml細胞培養(yǎng)物培養(yǎng)到濃度為1×107~2×107細胞/ml。如果自主復制質粒的雜合基因表達,可使用一種適當培養(yǎng)基對存在質粒的菌株進行篩選。
2.在冰上冷卻細胞,離心收集。注意:以下步驟保持細胞在冰上。
3.棄上清液,將細胞懸浮于250μl裂解緩沖液中,然后置-20℃凍結,以備的第二天測定。以下步驟均在1.5ml離心管中進行。
裂解緩沖液:
100 mmol/L Tris-HCl (pH8)
1 mmol/L 二硫蘇糖醇
20% 甘油
4.若細胞凍結,可在冰上將其凍結。加玻珠恰好到液面下,再加12.5μl PMSF母液。
5.以高速振蕩混合6次,每次15秒,間歇時放在冰上。
6.加入250μl的裂解緩沖液,用1000μl移液器插到離心管底部抽打使其充分混勻。
7.離心15分鐘澄清提取物。如果活性成分存在于顆粒狀碎片中,則可用未澄清的上清液,而測定的混合物將在步驟8澄清。
8.測定:
a. 加10~100μl抽提物到0.9ml的Z緩沖液中,用裂解緩沖液定容至1ml。
Z緩沖液:
16.1 g Na2HPO4•7H2O
5.5 g NaH2PO4•H2O
0.75 g KCl</P< p>
0.246 g MgSO4•7H2O
2.7 ml β-巰基乙醇
用蒸餾水定容至1升
調pH至7.0,保存于4℃
b. 在28℃水浴中將混合物保溫5分鐘。
c. 加入0.2ml臨硝基苯-β-D半乳吡喃糖苷(ONPG)母液,開始反應,注意準確時間,在28℃下保溫至混合物產(chǎn)生淡黃色。
d. 加入0.5ml碳酸鈉母液終止反應,注意準確記錄反應終止的時間,在420nm波長下測定光密度。
9.采用Bradford(1976)染料結合測定法測定抽提物中的蛋白質濃度。
a. 用蒸餾水將Bradford試劑稀釋5倍。用Whatman540號濾紙過濾稀釋試劑。
b. 加10~20μl抽提物到1ml稀釋試劑中,并混合。在595nm波長下測定形成的藍色溶液。用一次性塑料比色杯以防止形成藍膜影響測定結果。
c. 將BSA溶解于裂解緩沖液中,選用幾個不同稀釋度(0.1~1mg/ml)制成標準曲線。
10. 根據(jù)下面公式計算抽提物的特異活性:
( OD420×1.7) /(0.0045×蛋白質×抽提物體積×時間)
2) 通透細胞測定法
1.按上述方法培養(yǎng)細胞,測定培養(yǎng)物的OD600,當培養(yǎng)物細胞密度達1×106~1×107細胞/ml,同方法1離心收集細胞。
2.棄上清液,將細胞懸浮于1ml Z緩沖液中。
3.加入3滴氯仿和2滴0.1% SDS,高速振蕩10秒鐘。
4.28℃下預保溫樣品5分鐘,同方法1加入0.2ml ONPG開始反應。
5.當試管中的樣品變?yōu)榈S色時,加入0.5ml碳酸鈉母液終止反應。注意在測定時所花時間,離心10分鐘,棄細胞碎片和沉淀物。
6.測定反應物OD420的光密度。
7.β-半乳糖苷酶的活性單位為:
OD420 /(培養(yǎng)物OD600的光密度×測定體積×時間)

 

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