活體動(dòng)物體內(nèi)成像技術(shù)是指應(yīng)用影像學(xué)方法，對(duì)活體狀態(tài)下的生物過(guò)程進(jìn)行組織、細(xì)胞和分子水平的定性和定量研究的技術(shù)?；铙w動(dòng)物體內(nèi)成像技術(shù)主要分為可見光成像 (optical imaging)、核素成像（radio-nuclear imaging）、核磁共振（magnetic resonance imaging ，MRI）成像和超聲（ultrasound）成像、計(jì)算機(jī)斷層攝影（computed tomography ，CT）成像五大類，其中可見光成像和核素成像特別適合研究分子、代謝和生理學(xué)事件，通常稱為功能成像；超聲成像和CT則適合于解剖學(xué)成像，通常稱為結(jié)構(gòu)成像。ELISA試劑盒
功能成像與結(jié)構(gòu)成像比較，前者更能夠反映細(xì)胞或基因表達(dá)的空間和時(shí)間分布，從而了解活體動(dòng)物體內(nèi)的相關(guān)生物學(xué)過(guò)程、特異性基因功能和相互作用。所以，活體動(dòng)物體內(nèi)功能成像技術(shù)可用于觀察和追蹤靶細(xì)胞、基因的表達(dá)，同時(shí)檢測(cè)多種分子事件，優(yōu)化藥物和基因治療方案，從分子和細(xì)胞水平對(duì)藥物療效進(jìn)行觀察，從整體動(dòng)物水平上評(píng)估疾病發(fā)展過(guò)程，對(duì)同一個(gè)動(dòng)物進(jìn)行時(shí)間、環(huán)境、發(fā)展和治療影響跟蹤。由于功能成像的諸多優(yōu)勢(shì)，這項(xiàng)技術(shù)廣泛應(yīng)用于生命科學(xué)、醫(yī)學(xué)研究及藥物開發(fā)等方面，本文重點(diǎn)介紹活體動(dòng)物可見光成像技術(shù)。
體內(nèi)可見光成像(optical in vivo imaging)技術(shù)主要包括生物發(fā)光(bioluminescence)與熒光(fluorescence)成像兩種技術(shù)。生物發(fā)光成像是用熒光素酶(luciferase)基因標(biāo)記細(xì)胞或DNA，利用其產(chǎn)生的蛋白酶與相應(yīng)底物發(fā)生生化反應(yīng)產(chǎn)生生物體內(nèi)的探針光信號(hào)；而熒光成像則是采用熒光報(bào)告基因（如GFP、RFP）或Cyt及dyes等熒光染料進(jìn)行標(biāo)記，利用熒光蛋白或染料產(chǎn)生的熒光就可以形成體內(nèi)的熒光光源。前者是動(dòng)物體內(nèi)的自發(fā)光，不需要激發(fā)光源，可通過(guò)高度靈敏的CCD直接捕捉光信號(hào)，而后者則需要外界激發(fā)光源的激發(fā)才可以捕捉發(fā)光信號(hào)。傳統(tǒng)的動(dòng)物實(shí)驗(yàn)方法需要在不同的時(shí)間點(diǎn)宰殺實(shí)驗(yàn)動(dòng)物以獲得數(shù)據(jù), 得到多個(gè)時(shí)間點(diǎn)的實(shí)驗(yàn)結(jié)果。相比之下，體內(nèi)可見光成像技術(shù)通過(guò)對(duì)同一組實(shí)驗(yàn)對(duì)象在不同時(shí)間點(diǎn)進(jìn)行記錄，跟蹤同一觀察目標(biāo)（標(biāo)記細(xì)胞及基因）的移動(dòng)及變化，所得的數(shù)據(jù)也更加真實(shí)可信。另外, 這一技術(shù)由于不涉及放射性物質(zhì)，具有操作簡(jiǎn)單，所得結(jié)果直觀，靈敏度高等特點(diǎn), 在剛剛發(fā)展起來(lái)的幾年時(shí)間內(nèi)，已廣泛應(yīng)用于生命科學(xué)、醫(yī)學(xué)研究及藥物開發(fā)等方面。
一、活體生物發(fā)光成像技術(shù)
（一）技術(shù)原理
1. 標(biāo)記原理
哺乳動(dòng)物生物發(fā)光，一般是將Firefly luciferase基因（由554個(gè)氨基酸構(gòu)成，約50KD）即熒光素酶基因整合到預(yù)期觀察的細(xì)胞染色體DNA上以表達(dá)熒光素酶，培養(yǎng)出能穩(wěn)定表達(dá)熒光素酶的細(xì)胞株，當(dāng)細(xì)胞分裂、轉(zhuǎn)移、分化時(shí), 熒光素酶也會(huì)得到持續(xù)穩(wěn)定的表達(dá)?；?、細(xì)胞和活體動(dòng)物都可被熒光素酶基因標(biāo)記。將標(biāo)記好的細(xì)胞接種到實(shí)驗(yàn)動(dòng)物體內(nèi)后，當(dāng)外源（腹腔或靜脈注射）給予其底物熒光素(luciferin)，即可在幾分鐘內(nèi)產(chǎn)生發(fā)光現(xiàn)象。這種酶在ATP，氧存在的條件下，催化熒光素的氧化反應(yīng)才可以發(fā)光，因此只有在活細(xì)胞內(nèi)才會(huì)產(chǎn)生發(fā)光現(xiàn)象，并且發(fā)光光強(qiáng)度與標(biāo)記細(xì)胞的數(shù)目線性相關(guān)。ELISA試劑盒
除Firefly Luciferase外，有時(shí)也會(huì)用到Renilla Luciferase。二者的底物不一樣，前者的底物是熒光素（D-luciferin），后者的底物是coelentarizine。二者的發(fā)光波長(zhǎng)不一樣，前者所發(fā)的光波長(zhǎng)在540~600nm，后者所發(fā)的光波長(zhǎng)在460~540nm左右。前者所發(fā)的光更容易透過(guò)組織，后者在體內(nèi)的代謝比前者快，而且特異性沒(méi)有前者好，所以大部分活體實(shí)驗(yàn)使用Firefly Luciferase作為報(bào)告基因，如果需要雙標(biāo)記，也可采用后者作為備選方案。
熒光素酶的發(fā)光是生物發(fā)光，不需要激發(fā)光，但需要底物熒光素。熒光素在氧氣、ATP存在的條件下和熒光素酶發(fā)生反應(yīng)，生成氧化熒光素(oxyluciferin)，并產(chǎn)生發(fā)光現(xiàn)象。
對(duì)于細(xì)菌標(biāo)記，一般利用發(fā)光酶基因操縱子luxABCDE或luxCDABE，其由控制的編碼熒光素酶的基因和編碼熒光素酶底物合成酶的基因組成。利用這種辦法進(jìn)行標(biāo)記的細(xì)菌會(huì)持續(xù)發(fā)光，不需要外源性底物。但是一般細(xì)菌標(biāo)記需要轉(zhuǎn)座子的幫助把外源基因插入到細(xì)菌染色體內(nèi)穩(wěn)定表達(dá)。
2. 底物熒光素的特點(diǎn)
熒光素由于諸多優(yōu)點(diǎn)得到廣大科研人員的青睞，主要特點(diǎn)如下：
(1) 熒光素不會(huì)影響動(dòng)物的正常生理功能。
(2)熒光素是280道爾頓的小分子，水溶性和脂溶性都非常好，很容易穿透細(xì)胞膜和血腦屏障。
(3) 熒光素在體內(nèi)擴(kuò)散速度快，可通過(guò)腹腔注射或尾部靜脈注射進(jìn)入動(dòng)物體內(nèi)。腹腔注射擴(kuò)散較慢，持續(xù)發(fā)光長(zhǎng)。熒光素腹腔注射老鼠后約1min后表達(dá)熒光素酶的細(xì)胞開始發(fā)光，10min后強(qiáng)度達(dá)到穩(wěn)定的zui高點(diǎn)，在zui高點(diǎn)持續(xù)約20~30 min后開始衰減，約3h后熒光素排除，發(fā)光全部消失，*檢測(cè)時(shí)間是在注射后15~35min之間；若進(jìn)行熒光素靜脈注射，擴(kuò)散快，但發(fā)光持續(xù)時(shí)間很短?？蒲腥藛T根據(jù)大量的實(shí)驗(yàn)總結(jié)出熒光素的合適的用量是150mg/kg，即體重20克的小鼠需要3毫克的熒光素。
(4) 觀察時(shí)間的間隔沒(méi)有zui短限制，只要觀察的條件控制一致就可以。雖然底物在動(dòng)物體內(nèi)有一定的代謝過(guò)程，但是上一次底物的殘留曲線可以知道，可以控制對(duì)下一次觀察結(jié)果的影響。
3. 光學(xué)原理
光在哺乳動(dòng)物組織內(nèi)傳播時(shí)會(huì)被散射和吸收，光子遇到細(xì)胞膜和細(xì)胞質(zhì)時(shí)會(huì)發(fā)生折射現(xiàn)象，而且不同類型的細(xì)胞和組織吸收光子的特性并不一樣。血紅蛋白（hemoglobin）是造成體內(nèi)可見光被吸收的主要因素，其吸收可見光中藍(lán)綠光波段的大部分。但是在可見光大于600納米的紅光波段，血紅蛋白的吸收作用卻很小。因此，在偏紅光區(qū)域, 大量的光可以穿過(guò)組織和皮膚而被檢測(cè)到。利用活體動(dòng)物生物發(fā)光成像技術(shù)zui少可以檢測(cè)到皮下的幾百個(gè)細(xì)胞。當(dāng)然，由于發(fā)光源在老鼠體內(nèi)深度的不同可看到的zui少細(xì)胞數(shù)是不同的。一般認(rèn)為，每一厘米深度，發(fā)光強(qiáng)度衰減10倍，血液豐富的組織或器官（比如心臟、肝臟、肺臟）衰減多，與骨骼相鄰的組織或器官衰減少。在相同的深度情況下，檢測(cè)到的發(fā)光強(qiáng)度和細(xì)胞的數(shù)量具有非常好的線性關(guān)系，可由儀器量化檢測(cè)到的光強(qiáng)度，反映出細(xì)胞的數(shù)量。
（二）活體生物發(fā)光成像技術(shù)應(yīng)用領(lǐng)域
活體生物發(fā)光成像技術(shù)是一項(xiàng)在某些領(lǐng)域有不可替代優(yōu)勢(shì)的技術(shù)，比如腫瘤轉(zhuǎn)移研究、藥物開發(fā)、基因治療、干細(xì)胞示蹤等方面。
1．腫瘤學(xué)
活體生物發(fā)光成像技術(shù)能夠讓研究人員能夠直接快速的測(cè)量各種癌癥模型中腫瘤的生長(zhǎng)、轉(zhuǎn)移以及對(duì)藥物的反應(yīng)。其特點(diǎn)是*的靈敏度使微小的腫瘤病灶（少到幾百個(gè)細(xì)胞）也可以被檢測(cè)到，比傳統(tǒng)方法的靈敏度大大提高了；非常適合于腫瘤體內(nèi)生長(zhǎng)的定量分析；避免由于宰殺老鼠而造成的組間差異；節(jié)省動(dòng)物成本。由于以上特點(diǎn)，使基于轉(zhuǎn)移模型、原位模型、自發(fā)腫瘤模型等方面的腫瘤學(xué)研究得到發(fā)展。建立腫瘤轉(zhuǎn)移模型，可以觀察腫瘤轉(zhuǎn)移情況，進(jìn)一步探討腫瘤轉(zhuǎn)移的機(jī)制；可進(jìn)行原位接種，觀察原位以及原位轉(zhuǎn)移模型，使腫瘤學(xué)研究更接近腫瘤臨床發(fā)病的微觀環(huán)境；通過(guò)建立自發(fā)腫瘤模型，可以觀察腫瘤發(fā)生機(jī)理。ELISA試劑盒
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