胃蛋白酶提取法中分離純化技術(shù)的研究進(jìn)展
摘要:本文就胃蛋白酶的生物提取法,對(duì)其在過(guò)程中的分離、純化技術(shù)展開綜述。其中,分離技術(shù)主要介紹了:鹽析法、有機(jī)溶劑沉淀法、底物親和法、透析法。純化技術(shù)主要介紹了:凝膠過(guò)濾法、透析離子交換法。綜合比較各分離純化方法的特點(diǎn),得到*的分離純化方法有機(jī)溶劑與鹽析共沉淀法、膜分離技術(shù)、等電點(diǎn)沉淀法與底物親和法。
關(guān)鍵詞:胃蛋白酶 分離 純化 應(yīng)用
.生物提取法胃蛋白酶
1.1 工藝路線
(自溶、過(guò)濾) (脫脂、去雜質(zhì))
豬胃黏膜→自溶液→上清液
(濃縮、干燥)
→胃蛋白酶成品
1.2工藝過(guò)程
(1)原材料的選擇和預(yù)處理:胃蛋白酶原主要存在于胃粘膜基底部,采集原料時(shí)剝?nèi)〉恼衬ぶ睆酱笮∨c收率有關(guān)。一般取直徑10cm、深2-3mm的胃基底部粘膜zui適宜,每頭豬胃平均剝?nèi)≌衬?/font>100g左右。(2)自溶、過(guò)濾:在夾套鍋內(nèi)預(yù)先加水100升及鹽酸3.6-4升,加熱至50度時(shí),在攪拌下加入200千克豬胃黏膜,快速攪拌使酸度均勻,保持45—48度,消化3-4小時(shí),得自溶液。用紗布過(guò)濾除去未消化的組織尿蛋白,收集濾液。(3)脫脂、去雜質(zhì):將濾液降溫至30℃以下,加入15-20%氯仿或乙醚,攪勻后轉(zhuǎn)入沉淀脫脂器內(nèi),靜置24-48小時(shí),使雜質(zhì)沉淀,分出棄去,得脫脂酶液。(4)濃縮、干燥:取清酶液,在40℃以下減壓濃縮至原體積的1/4左右,再將濃縮液真空干燥。球磨過(guò)80-100目篩,即得胃蛋白酶粉。
2胃蛋白酶的分離技術(shù)
2.1有機(jī)溶劑法
可用于胃蛋白酶的初步提取濃縮。通常使用的有機(jī)溶劑有甲醇、乙醇、丙酮、異丙酮,其沉淀蛋白質(zhì)的能力為:丙酮>異丙酮>乙醇>甲醇。當(dāng)然此順序也不是一成不變的,因?yàn)檫€要受溫度、pH、離子強(qiáng)度等因素的影響。丙酮沉淀能力,但揮發(fā)損失多,價(jià)格較昂貴,所以工業(yè)上常采用乙醇作為沉淀劑。
胃蛋白酶提取法中分離純化技術(shù)的研究進(jìn)展 2.2鹽析法
鹽析法是酶制劑工業(yè)中常用方法之一,硫酸鎂、硫酸銨、硫酸鈉是常用的鹽析劑,其中用的zui多的是硫酸銨。美國(guó)(2,701,228)改進(jìn)后,用鋅鹽沉淀胃酶。當(dāng)母液含醇(或酮)在50%--55%、pH在5.0—5.2時(shí)幾乎全部胃酶可以用醋酸鋅沉淀,沉淀物為胃酶的鋅鹽,然后用金屬螯合劑除去鋅鹽,得15000—16000倍活力的酶,收集率為5.0%--5.5%。此法較上述有機(jī)溶劑沉淀所得的胃酶活力和得率都高。
2.3底物親和法
底物親和法是利用酶(胃蛋白酶)與其底物(酪蛋白)的親和性,從胃粘膜中提取得到胃蛋白酶。使底物和酶在pH2.5的乳酸緩沖液中充分結(jié)合,然后調(diào)pH至4(底物的等電點(diǎn))沉淀底物和酶的結(jié)合物,隨后讓沉淀物再溶解于乳酸緩沖液中,添加低濃度的SDS將底物和酶分離,得到酶—SDS復(fù)合物,再進(jìn)一步分離純化。陳躬瑞(2001)成功的應(yīng)用此法對(duì)蛇胃蛋白酶進(jìn)行了實(shí)驗(yàn)室分離,得率大約為30%。與傳統(tǒng)的分離方法比較,此法具有簡(jiǎn)單的優(yōu)點(diǎn),為后續(xù)的純化工藝避免了昂貴的活化試劑和配基的使用,同時(shí)具有較高的特異性。【2】
2.4透析法
胃蛋白酶的分離過(guò)程中還經(jīng)常用到透析法。該法是利用蛋白質(zhì)大分子對(duì)半透膜的不可透過(guò)性而與小分子物質(zhì)及鹽分開的。由于透析主要是擴(kuò)散過(guò)程,如果袋內(nèi)外的鹽濃度相等,擴(kuò)散就會(huì)停止,因此要經(jīng)常換溶劑,一般一天換2—3次。如在冷處透析,則溶劑也要預(yù)先冷卻,避免樣品變性。透析時(shí)的鹽是否除凈,可用化學(xué)試劑或電導(dǎo)儀來(lái)檢測(cè)?!?/font>1】
3胃蛋白酶的純化技術(shù)
3.1凝膠過(guò)濾法
美國(guó)在20世紀(jì)60年代研究結(jié)晶為蛋白酶的 工藝時(shí),是將75mg的胃蛋白酶原樣本溶解在8mL的蒸餾水中(pH5.0~6.0),在14℃±1。,pH2.0下,保持20min激活。然后用磺乙基Spandex G-25層析,zui后用羥基磷灰石進(jìn)行色譜層析。結(jié)果表明用層析法得到的胃蛋白酶為單一物質(zhì)純品。
3.2離子交換層析法
陳躬瑞等人在純化蘄蛇胃蛋白酶時(shí)將SDS沉淀后的上清液上樣到預(yù)先用0.05mol/L乙酸緩沖液(pH5.0)平衡的DEAE—TOYOPEARL離子交換色譜柱(4.6mm X 100mm)上,用0~O.25mo1/L氯化鈉梯度洗脫,流速為1ml/min。得到的酶在5O℃30min有較高的活性,有望應(yīng)用于高溫食品加工中 ?!?/font>2】
基于以上對(duì)胃蛋白酶的分離純化技術(shù)的比較分析可以看出,長(zhǎng)期以來(lái)分離提取技術(shù)一直沒有取得較大的突破,用有機(jī)溶劑、鹽析等技術(shù)得到的天然胃蛋白酶產(chǎn)品,純度、生物活性愈將不能滿足醫(yī)藥品和工業(yè)日益增長(zhǎng)的需要。隨著分離科學(xué)技術(shù)的不斷發(fā)展,采用新型分離技術(shù)分離胃蛋白酶已勢(shì)在必行。因此,大多數(shù)學(xué)者認(rèn)為以下幾種技術(shù)是胃蛋白酶分離純化的方向。
胃蛋白酶提取法中分離純化技術(shù)的研究進(jìn)展 3.2.1有機(jī)溶劑與鹽析共沉淀
有機(jī)溶劑和鹽析法都是分離純化胃蛋白酶的傳統(tǒng)方法,有其各自的特點(diǎn)。如果將有機(jī)溶劑和鹽析配合使用,不僅可以降低鹽的用量,而且可以不同程度的消除各自分離純化所帶來(lái)的問(wèn)題,得到的胃蛋白酶純度和活性也會(huì)有所增加。
3.2.2膜分離技術(shù)
分離膜是一種特殊的、具有選擇性透過(guò)功能的薄層物質(zhì),能利用分子大小實(shí)現(xiàn)分離,從而起到濃縮和分離純化的作用。由于其可在維持原生物體系環(huán)境的條件下實(shí)現(xiàn)分離,并可地濃縮、富集產(chǎn)物,有效地去除雜質(zhì),加之操作簡(jiǎn)單,結(jié)構(gòu)緊湊、能耗低,過(guò)程簡(jiǎn)化,無(wú)一次污染,也將成為胃蛋白酶分離純化工藝的研究方向。
3.2.3等電點(diǎn)沉淀法與底物親和法
胃蛋白酶具有極低的等電點(diǎn)(如豬胃蛋白pH1.0),但胃蛋白酶的分離純化技術(shù)中等電點(diǎn)沉淀法未見報(bào)道,如果此方法可實(shí)現(xiàn),那將大大縮短分離純化的時(shí)間。底物親和法是分離純化胃蛋白酶的新亮點(diǎn),但其工藝條件還不成熟,尤其是在分離底物和酶的復(fù)合物時(shí),SDS的添加量有待研究。
4 結(jié)論
有人預(yù)言,21世紀(jì)將是生物技術(shù)的世紀(jì),尤其是生物制藥技術(shù)的世紀(jì)。生物制藥被譽(yù)為21世紀(jì)的“朝陽(yáng)產(chǎn)業(yè)”。得益于生物制藥技術(shù)的酶類藥物也日趨成熟。的胃蛋白酶分離純化工藝、技術(shù)和設(shè)備的出現(xiàn),人們必將開發(fā)出的胃蛋白酶提取工藝。這對(duì)于提高功能性胃蛋白酶產(chǎn)品、提高率、降低成本和改善人民生活水平起著舉足輕重的作用。而胃蛋白酶單一組分的制備分離,可為胃蛋白酶的研究開發(fā)提供標(biāo)準(zhǔn)品,同時(shí)能為后期胃蛋白酶單一組分生理活性的研究提供必要的物質(zhì)保障。