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胃蛋白酶提取法中分離純化技術(shù)的研究進(jìn)展

摘要：本文就胃蛋白酶的生物提取法，對(duì)其在過程中的分離、純化技術(shù)展開綜述。其中，分離技術(shù)主要介紹了：鹽析法、有機(jī)溶劑沉淀法、底物親和法、透析法。純化技術(shù)主要介紹了：凝膠過濾法、透析離子交換法。綜合比較各分離純化方法的特點(diǎn)，得到*的分離純化方法有機(jī)溶劑與鹽析共沉淀法、膜分離技術(shù)、等電點(diǎn)沉淀法與底物親和法。

關(guān)鍵詞：胃蛋白酶 分離 純化  應(yīng)用 

．生物提取法胃蛋白酶

1．1 工藝路線 

          （自溶、過濾）       （脫脂、去雜質(zhì)）

豬胃黏膜→自溶液→上清液

（濃縮、干燥）

→胃蛋白酶成品

1.2工藝過程

（1）原材料的選擇和預(yù)處理：胃蛋白酶原主要存在于胃粘膜基底部，采集原料時(shí)剝?nèi)〉恼衬ぶ睆酱笮∨c收率有關(guān)。一般取直徑10cm、深2-3mm的胃基底部粘膜zui適宜，每頭豬胃平均剝?nèi)≌衬?/font>100g左右。（2）自溶、過濾：在夾套鍋內(nèi)預(yù)先加水100升及鹽酸3.6-4升，加熱至50度時(shí)，在攪拌下加入200千克豬胃黏膜，快速攪拌使酸度均勻，保持45—48度，消化3-4小時(shí)，得自溶液。用紗布過濾除去未消化的組織尿蛋白，收集濾液。（3）脫脂、去雜質(zhì)：將濾液降溫至30℃以下，加入15-20％氯仿或乙醚，攪勻后轉(zhuǎn)入沉淀脫脂器內(nèi)，靜置24-48小時(shí)，使雜質(zhì)沉淀，分出棄去，得脫脂酶液。（4）濃縮、干燥：取清酶液，在40℃以下減壓濃縮至原體積的1／4左右，再將濃縮液真空干燥。球磨過80-100目篩，即得胃蛋白酶粉。

2胃蛋白酶的分離技術(shù)

2.1有機(jī)溶劑法

可用于胃蛋白酶的初步提取濃縮。通常使用的有機(jī)溶劑有甲醇、乙醇、丙酮、異丙酮，其沉淀蛋白質(zhì)的能力為：丙酮＞異丙酮＞乙醇＞甲醇。當(dāng)然此順序也不是一成不變的，因?yàn)檫€要受溫度、pH、離子強(qiáng)度等因素的影響。丙酮沉淀能力，但揮發(fā)損失多，價(jià)格較昂貴，所以工業(yè)上常采用乙醇作為沉淀劑。

胃蛋白酶提取法中分離純化技術(shù)的研究進(jìn)展

2．2鹽析法

鹽析法是酶制劑工業(yè)中常用方法之一，硫酸鎂、硫酸銨、硫酸鈉是常用的鹽析劑，其中用的zui多的是硫酸銨。美國（2，701,228）改進(jìn)后，用鋅鹽沉淀胃酶。當(dāng)母液含醇（或酮）在50%--55%、pH在5.0—5.2時(shí)幾乎全部胃酶可以用醋酸鋅沉淀，沉淀物為胃酶的鋅鹽，然后用金屬螯合劑除去鋅鹽，得15000—16000倍活力的酶，收集率為5.0%--5.5%。此法較上述有機(jī)溶劑沉淀所得的胃酶活力和得率都高。

2.3底物親和法

底物親和法是利用酶（胃蛋白酶）與其底物（酪蛋白）的親和性，從胃粘膜中提取得到胃蛋白酶。使底物和酶在pH2.5的乳酸緩沖液中充分結(jié)合，然后調(diào)pH至4（底物的等電點(diǎn)）沉淀底物和酶的結(jié)合物，隨后讓沉淀物再溶解于乳酸緩沖液中，添加低濃度的SDS將底物和酶分離，得到酶—SDS復(fù)合物，再進(jìn)一步分離純化。陳躬瑞（2001）成功的應(yīng)用此法對(duì)蛇胃蛋白酶進(jìn)行了實(shí)驗(yàn)室分離，得率大約為30%。與傳統(tǒng)的分離方法比較，此法具有簡(jiǎn)單的優(yōu)點(diǎn)，為后續(xù)的純化工藝避免了昂貴的活化試劑和配基的使用，同時(shí)具有較高的特異性?！?/font>2】

2.4透析法

胃蛋白酶的分離過程中還經(jīng)常用到透析法。該法是利用蛋白質(zhì)大分子對(duì)半透膜的不可透過性而與小分子物質(zhì)及鹽分開的。由于透析主要是擴(kuò)散過程，如果袋內(nèi)外的鹽濃度相等，擴(kuò)散就會(huì)停止，因此要經(jīng)常換溶劑，一般一天換2—3次。如在冷處透析，則溶劑也要預(yù)先冷卻，避免樣品變性。透析時(shí)的鹽是否除凈，可用化學(xué)試劑或電導(dǎo)儀來檢測(cè)?！?/font>1】

3胃蛋白酶的純化技術(shù)

3.1凝膠過濾法

美國在20世紀(jì)60年代研究結(jié)晶為蛋白酶的 工藝時(shí)，是將75mg的胃蛋白酶原樣本溶解在8mL的蒸餾水中（pH5．0～6．0），在14℃±1。，pH2．0下，保持20min激活。然后用磺乙基Spandex G-25層析，zui后用羥基磷灰石進(jìn)行色譜層析。結(jié)果表明用層析法得到的胃蛋白酶為單一物質(zhì)純品。

3.2離子交換層析法

陳躬瑞等人在純化蘄蛇胃蛋白酶時(shí)將SDS沉淀后的上清液上樣到預(yù)先用0．05mol／L乙酸緩沖液（pH5．0）平衡的DEAE—TOYOPEARL離子交換色譜柱（4．6mm X 100mm）上，用0～O．25mo1／L氯化鈉梯度洗脫，流速為1ml／min。得到的酶在5O℃30min有較高的活性，有望應(yīng)用于高溫食品加工中 ?！?/font>2】

基于以上對(duì)胃蛋白酶的分離純化技術(shù)的比較分析可以看出，長(zhǎng)期以來分離提取技術(shù)一直沒有取得較大的突破，用有機(jī)溶劑、鹽析等技術(shù)得到的天然胃蛋白酶產(chǎn)品，純度、生物活性愈將不能滿足醫(yī)藥品和工業(yè)日益增長(zhǎng)的需要。隨著分離科學(xué)技術(shù)的不斷發(fā)展，采用新型分離技術(shù)分離胃蛋白酶已勢(shì)在必行。因此，大多數(shù)學(xué)者認(rèn)為以下幾種技術(shù)是胃蛋白酶分離純化的方向。

胃蛋白酶提取法中分離純化技術(shù)的研究進(jìn)展

3.2．1有機(jī)溶劑與鹽析共沉淀

有機(jī)溶劑和鹽析法都是分離純化胃蛋白酶的傳統(tǒng)方法，有其各自的特點(diǎn)。如果將有機(jī)溶劑和鹽析配合使用，不僅可以降低鹽的用量，而且可以不同程度的消除各自分離純化所帶來的問題，得到的胃蛋白酶純度和活性也會(huì)有所增加。

3.2.2膜分離技術(shù)

分離膜是一種特殊的、具有選擇性透過功能的薄層物質(zhì)，能利用分子大小實(shí)現(xiàn)分離，從而起到濃縮和分離純化的作用。由于其可在維持原生物體系環(huán)境的條件下實(shí)現(xiàn)分離，并可地濃縮、富集產(chǎn)物，有效地去除雜質(zhì)，加之操作簡(jiǎn)單，結(jié)構(gòu)緊湊、能耗低，過程簡(jiǎn)化，無一次污染，也將成為胃蛋白酶分離純化工藝的研究方向。

3.2.3等電點(diǎn)沉淀法與底物親和法

胃蛋白酶具有極低的等電點(diǎn)（如豬胃蛋白pH1．0），但胃蛋白酶的分離純化技術(shù)中等電點(diǎn)沉淀法未見報(bào)道，如果此方法可實(shí)現(xiàn)，那將大大縮短分離純化的時(shí)間。底物親和法是分離純化胃蛋白酶的新亮點(diǎn)，但其工藝條件還不成熟，尤其是在分離底物和酶的復(fù)合物時(shí)，SDS的添加量有待研究。

4 結(jié)論

有人預(yù)言，21世紀(jì)將是生物技術(shù)的世紀(jì)，尤其是生物制藥技術(shù)的世紀(jì)。生物制藥被譽(yù)為21世紀(jì)的“朝陽產(chǎn)業(yè)”。得益于生物制藥技術(shù)的酶類藥物也日趨成熟。的胃蛋白酶分離純化工藝、技術(shù)和設(shè)備的出現(xiàn)，人們必將開發(fā)出的胃蛋白酶提取工藝。這對(duì)于提高功能性胃蛋白酶產(chǎn)品、提高率、降低成本和改善人民生活水平起著舉足輕重的作用。而胃蛋白酶單一組分的制備分離，可為胃蛋白酶的研究開發(fā)提供標(biāo)準(zhǔn)品，同時(shí)能為后期胃蛋白酶單一組分生理活性的研究提供必要的物質(zhì)保障。