實時熒光定量PCR檢測的技術(shù)及原理
一：實時熒光定量PCR檢測的技術(shù)：
1、是在PCR反應(yīng)體系中加入熒光染料或熒光探針，利用熒光信號積累實時監(jiān)測整個PCR反應(yīng)進(jìn)程，后通過標(biāo)準(zhǔn)曲線對未知模板進(jìn)行定量分析。
2、具有操作簡便、快速，高通量，而且高敏感性等特點(diǎn)，該技術(shù)在分子診斷、分子生物學(xué)研究、動植物檢疫以及食品安全檢測等方面有廣泛的應(yīng)用。
3、不僅實現(xiàn)了PCR從定性到定量的飛躍，而且與常規(guī)PCR相比，具有靈敏度高、特異性強(qiáng)、有效解決PCR污染問題、自動化程度高等特點(diǎn)。目前，該技術(shù)已廣泛應(yīng)用于分子生物學(xué)、醫(yī)學(xué)等學(xué)科和基礎(chǔ)研究領(lǐng)域，特別是在現(xiàn)代農(nóng)業(yè)轉(zhuǎn)基因作物的定性檢測、品系鑒定、轉(zhuǎn)基因成分含量的檢測中發(fā)揮著重要作用。
二：實時熒光定量PCR檢測的原理：
1、是以熒光共振能量轉(zhuǎn)移原理為基礎(chǔ)。熒光共振能量轉(zhuǎn)移原理是當(dāng)一個熒光分子(供體分子)的熒光光譜與另一個熒光分子(受體分子)的激發(fā)光譜重疊時，供體熒光分子自身的熒光強(qiáng)度衰減，受體熒光分子的熒光強(qiáng)度增強(qiáng)。
2、Ct值是指每個反應(yīng)管內(nèi)的熒光信號到達(dá)設(shè)定的閾值時所經(jīng)歷的循環(huán)數(shù)。Ct值是實時熒光PCR中一個很關(guān)鍵的因素。
3、每個模板的Ct值與該模板的起始拷貝數(shù)的對數(shù)存在線性關(guān)系，起始拷貝數(shù)越多，Ct值越小。利用已知起始拷貝數(shù)的標(biāo)準(zhǔn)品可做出標(biāo)準(zhǔn)曲線。
4、因此，根據(jù)熒光探針的發(fā)光基團(tuán)所發(fā)出的熒光強(qiáng)度與PCR產(chǎn)物的數(shù)量呈對應(yīng)關(guān)系，只要對熒光信號進(jìn)行“實時”檢測并獲得未知樣品的Ct值，即可從標(biāo)準(zhǔn)曲線上計算出該樣品的起始拷貝數(shù)。與普通PCR相比，可以利用熒光信號實時監(jiān)測PCR反應(yīng)過程中每一個循環(huán)擴(kuò)增產(chǎn)物的變化，可以對初始模板量進(jìn)行定量分析。
簡單地說，基本原理就是樣本核酸擴(kuò)增呈指數(shù)增長，在反應(yīng)體系和條件*一致的情況下，樣本DNA含量與擴(kuò)增產(chǎn)物的對數(shù)成正比，由于反應(yīng)體系中的熒光染料或熒光標(biāo)記物(熒光探針)與擴(kuò)增產(chǎn)物結(jié)合發(fā)光，其熒光量與擴(kuò)增產(chǎn)物量成正比，因此通過熒光量的檢測就可以測定樣本核酸量。
總結(jié)：實時熒光定量PCR檢測的技術(shù)及原理小編就知道這么多，看完本文您就應(yīng)該有了基本的認(rèn)識和了解相信大家都明白了吧！總的來說，希望對大家有所幫助。
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